ردیابی و تعیین برخی خصوصیات مولکولی apple chlorotic leaf spot virus در مناطق سیب کاری استان های آذربایجان غربی و اصفهان

سیب درختی یکی از مهمترین میوه های مناطق سردسیری و معتدله می باشد که میوه تازه و فراورده آن بزرگترین تجارت جهانی را در بین میوه های باغی دارا می باشد. ویروس لکه سبزرد برگ سیب apple chlorotic leaf spot virus (aclsv) عضو تیپ جنس trichovirus، یکی ازمهمترین ویروس های بیماری زا روی سیب در سراسر جهان بوده و خسارات فراوانی به این محصول وارد می - کند. ویروس علائمی از قبیل لکه های کلروتیک، بد شکلی و پیچیدگی برگ و میوه در سیب ایجاد می کند. در این تحقیق به منظور ردیابی و تعیین برخی خصوصیات مولکولی ویروس لکه سبزرد برگ سیب در مناطق سیب کاری استان های آذربایجان غربی و اصفهان در سال های 1388 و 1389 از برگ و شکوفه های درختان سیب دارای علائم ویروسی در مناطقی از این دو استان نمونه برداری انجام شد. از شکوفه ها و برگ های دارای علایم آر. ان.ای دو رشته ای استخراج و به عنوان الگو در آزمون pcr rt- استفاده شد. آزمون rt-pcr با استفاده از آغازگرهای اختصاصی aclsv (a52/a53 ، aclsv-r/aclsv-f ، aclsv-cpf/aclsv-cpr) انجام شد. تکثیر قطعات مورد انتظار به ترتیب با اندازه های bp 358، bp677 و bp566 آلودگی تعدادی از نمونه ها به ویروس را تایید کرد. برای تکثیر ژن پروتئین پوششی (cp) ویروس از جفت آغازگر aclsvcpf/aclsv-r استفاده شد و قطعه bp792 در نمونه های مورد بررسی تکثیر شد. مایه زنی یکی از نمونه های آلوده به chenopodium quinoa و chenopodium amaranticolor باعث تولید لکه های کلروتیک و نکروتیک در آن ها شد. آلودگی این گیاهان به aclsv با آزمون rt-pcr با جفت آغازگر aclsv-r/aclsv-cpf مورد تایید قرار گرفت. جهت بررسی تفاوت ها و شباهت های احتمالی بین جدایه ها از روش pcr-rflp استفاده شد. بدین منظور تعداد 12 نمونه با توجه به رقم میزبان و منطقه جغرافیایی که قبلا قطعه bp792 را تکثیر کرده بودند برای آنالیزهای pcr- rflp قطعه ی تکثیر شده با استفاده از آنزیم های محدودگر msei و taqi مورد هضم آنزیمی قرار گرفتند. بررسی 12 جدایه ویروس توسط آنزیم های مزبورحاکی از وجود تنوع در بین جدایه های مختلف بود. پس از آنالیز pcr-rflp ، به منظور تعیین دقیق شباهت ها و تفاوت های موجود بین جدایه های ویروس لکه سبزرد برگ سیب و تعیین قرابت ژنتیکی آنها، با توجه به الگوی برشی جدایه ها تعداد هفت جدایه جهت همسانه سازی و توالی یابی انتخاب شدند. مقایسه توالی نوکلئوتیدی جدایه های ایرانی aclsv با توالی های موجود در بانک ژن به کمک ابزار جستجوی blast ، تشابه بالای آنها را با توالی های گزارش شده از سایر نقاط جهان نشان داد. مقایسه توالی آمینواسیدی ژن پروتئین پوششی جدایه هایaclsv ایرانی با توالی متناظر تعدادی از جدایه های aclsv موجود در بانک ژن، بیشترین درصد تشابه را با جدایهgc10h از ژاپن به میزان 9/96 درصد و کمترین تشابه را با جدایه tatao از امریکا به میزان 6/73 درصد نشان داد. این نتایج با رسم درخت تبارزایی بر اساس توالی آمینواسیدی ژن پروتئین پوششی تایید شد. این نتایج نشان دهنده ارتباط بیشتر جدایه ایرانی با جدایه هایی از ژاپن می باشد.